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分析ELISA生物學(xué)功能評(píng)價(jià)和檢測(cè)分析方法雙重間接性

日期:2022-01-20 11:03:00 by
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摘要:

本文從整體角度分析生物學(xué)功能評(píng)價(jià)和檢測(cè)分析方法的雙重間接性,并以最基本的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn),配體受體結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)為實(shí)例,介紹采用ELISA技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行配體受體結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)開發(fā)的一般過程,區(qū)分以樣品以親和力大小比較和定量檢測(cè)為使用目的兩個(gè)方面具體應(yīng)用及方法質(zhì)量的初步評(píng)價(jià),并討論采用同不同檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)的通用原則。

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生物學(xué)功能評(píng)價(jià)和檢測(cè)分析方法的雙重間接性


生物學(xué)檢測(cè)方法研究生物活性物質(zhì)之間相互作用及其影響,或者利用生物活性物質(zhì)之間相互作用進(jìn)行定量,是生命科學(xué)研究領(lǐng)域和藥物研發(fā)過程中必不可少的工具。有別于色譜質(zhì)譜拉曼光譜等儀器分析方法,生物學(xué)檢測(cè)方法往往是間接的,其間接性導(dǎo)致方法可靠性,穩(wěn)定性等相對(duì)于儀器分析方法較差。從整體宏觀的角度了解生物學(xué)檢測(cè)方法的間接性是建立一個(gè)穩(wěn)定的生物學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵因素之一。

儀器分析方法(a)研究的是樣品本身直接相關(guān)的特性,如樣品的分子量大小,樣品的電荷等;與此相對(duì),生物學(xué)檢測(cè)方法(b)首先要存在或者建立一個(gè)Test system,然后加入樣品反應(yīng),檢測(cè)樣品引起Test system的變化,其檢測(cè)和樣品本身是間接相關(guān),檢測(cè)目標(biāo)分子實(shí)體不是樣品本身,這是其檢測(cè)目標(biāo)的間接性。如某藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn),Test system為細(xì)胞,引起的變化是細(xì)胞的死亡,檢測(cè)目標(biāo)分子實(shí)體為代表活細(xì)胞的ATP濃度或者代表死細(xì)胞的LDH濃度。 


大多數(shù)生物學(xué)檢測(cè)方法存在一個(gè)復(fù)雜的Test system,樣品引起Test system的變化也需要在溫和的條件下進(jìn)行,這使得目標(biāo)分子很難進(jìn)行有效的分離并采用儀器分析方法進(jìn)行檢測(cè),需要引入熒光標(biāo)記抗體,酶標(biāo)抗體,或酶催化底物等和目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)轉(zhuǎn)換成信號(hào)值,建立信號(hào)值和目標(biāo)分子的間接聯(lián)系,這是檢測(cè)信號(hào)傳遞的間接性。如下圖所示,在一個(gè)ELISA直接法的實(shí)驗(yàn)中,樣品是抗體,檢測(cè)體系是抗原,引起的變化目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物,而信號(hào)值代表的是TMB催化產(chǎn)物,TMB催化產(chǎn)物經(jīng)過酶標(biāo)抗體和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物發(fā)生間接聯(lián)系,一個(gè)ELISA方法的質(zhì)量是由信號(hào)在間接的傳遞過程中是否和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物線性相關(guān)決定的。相關(guān)研究請(qǐng)參閱小編之前的文章ELISA常用原理類型方法和常見問題匯總


生物學(xué)功能評(píng)價(jià)和檢測(cè)分析方法的雙重間接性為檢測(cè)目標(biāo)的間接性和檢測(cè)信號(hào)傳遞的間接性。即使最為簡(jiǎn)單的生物學(xué)檢測(cè)方法,配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的應(yīng)用過程中由于這兩重的間接性導(dǎo)致其方法也變得無(wú)比復(fù)雜,存在很多的變量,很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果。一個(gè)檢測(cè)方法在方法開發(fā)的初期往往需要進(jìn)行分步的實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化方法的可靠性和穩(wěn)定性,并對(duì)建立的方法進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證。明確需要檢測(cè)的目標(biāo)分子,信號(hào)和目標(biāo)分子的關(guān)聯(lián)途徑是進(jìn)行方法學(xué)開發(fā),數(shù)據(jù)解讀和問題排查的基礎(chǔ)。


ELISA試劑盒競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)開發(fā)


一般來(lái)講,競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)主要涉及到三個(gè)物質(zhì),受體,配體和阻斷配體受體結(jié)合的樣品,如PD1受體,PD-L1配體,阻斷劑keyturda抗體,也常采用抗原,生物素化抗體,和阻斷抗原,生物素化抗體的樣品抗體組合。在競(jìng)爭(zhēng)法開發(fā)的初期是建立起受體,配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和測(cè)量范圍。具體到ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法開發(fā)上,主要包含兩個(gè)方面:

1.設(shè)置多個(gè)陰性陽(yáng)性對(duì)照組,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)信號(hào)值是真實(shí)代表目標(biāo)分子配體受體偶聯(lián)物。主要考察的是在間接的檢測(cè)過程中ELISA反應(yīng)過程采用的酶標(biāo)板材,酶聯(lián)抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示,嚴(yán)格來(lái)講在新建一個(gè)ELISA方法時(shí),需要建立一個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)組組5,需要建立多個(gè)陰性對(duì)照組組1-組4來(lái)確認(rèn)Test system中信號(hào)是和目標(biāo)分子相關(guān)。這是一個(gè)十分重要,也是十分容易被忽略的問題。除了組5能夠得較高的陽(yáng)性信號(hào),其他分組如果得到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào),整個(gè)方法得到的數(shù)據(jù)都是不可信的。組3和組5(黃色)是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的對(duì)照組,但是組4(藍(lán)色)的缺席會(huì)使得整個(gè)方法充滿分險(xiǎn)性,小編多個(gè)不同ELISA應(yīng)用方法學(xué)開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)表明,很多時(shí)候封閉劑起無(wú)法達(dá)到占據(jù)酶標(biāo)板材空白位置的目的,反應(yīng)配體或者反應(yīng)配體中的非特異成分可能會(huì)直接吸附在酶標(biāo)板材上,導(dǎo)致組4出現(xiàn)劑量依賴的假陽(yáng)性信號(hào)。在雜交瘤和噬菌體展示篩選測(cè)定時(shí),反應(yīng)配體溶液的復(fù)雜和多樣性,使得配體溶液總會(huì)存在某些陰性抗體或者克隆能夠和酶標(biāo)板材結(jié)合,成分組4的缺席會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的頻率大大增加。設(shè)置比較全的陰性對(duì)照組也有助于鎖定整個(gè)體系中哪些試劑發(fā)生了交叉反應(yīng),找到具體原因,方便更換試劑。 

2.包被受體相對(duì)于反應(yīng)配體的劑量曲線。在確認(rèn)Test system中陽(yáng)性信號(hào)能夠代表目標(biāo)檢測(cè)分子后,包被少量的受體,2倍梯度稀釋反應(yīng)配體12-16個(gè)點(diǎn)進(jìn)行全曲線擬合,選取EC80或者EC50的配體濃度作為競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被,受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml,采用不同稀釋濃度的酶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測(cè),整個(gè)劑量曲線有明顯的上,下平臺(tái)期,不同的酶聯(lián)濃度對(duì)信號(hào)的線性傳遞未造成明顯的影響,酶聯(lián)抗體起到了等比例將信號(hào)放大的作用,EC50為12ng/ml,EC80為40ng/ml。可選取100ng/ml 受體100ul包被,配體的競(jìng)爭(zhēng)濃度選EC80為40ng/ml,酶聯(lián)稀釋度選擇1:600以獲得較大的信噪比窗口,增加方法測(cè)量范圍。在競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)中EC80代表了配體在Test system中占據(jù)了受體80%的結(jié)合位點(diǎn),配體和受體在此相對(duì)狀態(tài)下,樣品對(duì)配體和受體的反應(yīng)的阻斷比較敏感。受體過多,可提供的結(jié)合位點(diǎn)較多,樣品和受體結(jié)合不會(huì)影響到配體和受體的結(jié)合;配體過多,樣品加入后相對(duì)于配體較少,競(jìng)爭(zhēng)不過配體,絕大多數(shù)配體依舊和受體結(jié)合,在兩種情況下樣品的加入都無(wú)法導(dǎo)致Test system發(fā)生明顯的變化(配體受體偶聯(lián)物減少),信號(hào)變化不明顯。 


建立好完整的Test system后,就是正式建立競(jìng)爭(zhēng)法的劑量曲線了。主要包含兩個(gè)方面的內(nèi)容

1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品(2倍梯度稀釋12-16個(gè)點(diǎn))混勻后加入包被好受體的酶標(biāo)板材反應(yīng),得到有明顯上下漸近線的全曲線,如下圖所示。 


2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行,選擇樣品合適的8個(gè)濃度梯度點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作流程,并初步評(píng)估方法的質(zhì)量。具體到應(yīng)用方面就是親和力大小比較和定量檢測(cè)方面。根據(jù)筆者的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法相同條件下的同一個(gè)曲線在濃度點(diǎn)細(xì)微調(diào)整下能夠滿足兩方面的需求,這是筆者開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn),希望業(yè)界更多的同行能夠進(jìn)行驗(yàn)證。下文會(huì)具體進(jìn)行兩方面應(yīng)用方法的初步評(píng)估。


ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)質(zhì)量的初步驗(yàn)證


當(dāng)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法開發(fā)以親和力大小比較為目的,往往會(huì)以IC50值評(píng)價(jià)待測(cè)樣品阻斷配體受體結(jié)合效果,IC50越小,待測(cè)樣品的阻斷效果越好。親和力競(jìng)爭(zhēng)法開發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺(tái)期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體到ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的方法學(xué)評(píng)價(jià),即制備相對(duì)于對(duì)照品理論效價(jià)為156%,125%,100%,80%,64%的樣品進(jìn)行檢測(cè),通過比較對(duì)照品和樣品的IC50,得到樣品相對(duì)于實(shí)測(cè)效價(jià),通過實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個(gè)濃度點(diǎn),進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示:該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn),得到的實(shí)測(cè)效價(jià)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中最主要的幾個(gè)概念,精密度,準(zhǔn)確度,線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異在5%以內(nèi),能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的ELISA競(jìng)爭(zhēng)法有較好的方法質(zhì)量。 

當(dāng)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法開發(fā)以定量為目的,選取7個(gè)點(diǎn)以理論濃度為X軸,信號(hào)值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,將對(duì)照品的信號(hào)值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測(cè)濃度值,多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測(cè)濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)上限,檢測(cè)下限,測(cè)量范圍,更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。如下圖所示,對(duì)照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi),回測(cè)濃度值和理論濃度的偏差在20%以內(nèi),初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺(tái)期的最低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺(tái)期點(diǎn)會(huì)嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。


總結(jié)和展望


本文以ELISA競(jìng)爭(zhēng)法方法學(xué)開發(fā)和初步方法學(xué)驗(yàn)證的案例概論了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)的通用原則,包含以下幾個(gè)步驟:

1. 鑒于生物學(xué)方法的雙重間接性,明確檢測(cè)的目標(biāo)分子,設(shè)置多個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組,理清信號(hào)值和檢測(cè)目標(biāo)分子的線性聯(lián)系;

2. 建立Test system,通過配體受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn),尋找合適的配體受體相對(duì)濃度以得到樣品對(duì)Test system的敏感性;

3. 加入梯度稀釋的樣品進(jìn)入Test system,繪制樣品相對(duì)于Test system的劑量全曲線;

4. 以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑閷?dǎo)向,分別對(duì)親和力大小比較為目的和大分子定量為目的進(jìn)行差異的濃度點(diǎn)選擇,并通過合規(guī)的方法學(xué)評(píng)價(jià)程序?qū)Ψ椒ǖ馁|(zhì)量進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。 

ELISA直接法和ELISA競(jìng)爭(zhēng)法有相同的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn),即親和力大小比較的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)USP1032,1033,1034;定量分析的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA競(jìng)爭(zhēng)法在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)于對(duì)照品濃度點(diǎn)的微調(diào)可以完成親和力大小比較和大分子定量?jī)煞矫鎽?yīng)用,這個(gè)有別于筆者之前的文章ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析對(duì)于ELISA直接法兩方面不同應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)條件,但是兩類方法的四種應(yīng)用均能夠通過驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)要求,只能說實(shí)踐出真知,不管白貓黑貓,能抓住老鼠的就是好貓了。

在體外所有的體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中,樣品引起檢測(cè)體系的變化,并以信號(hào)的形式展示出來(lái),這個(gè)應(yīng)該是體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法最通用的原則,有結(jié)合才會(huì)有功能,功能是對(duì)藥物引起的變化(響應(yīng)標(biāo)志物)的準(zhǔn)確定量。理解ELISA實(shí)驗(yàn)關(guān)于結(jié)合和定量的應(yīng)用以及方法質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于所有的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的開發(fā)和評(píng)價(jià)都有著十分重要的借鑒意義,ELISA里面有乾坤。

2012安進(jìn)公司的科學(xué)家宣稱53項(xiàng)癌癥著名論文中有47項(xiàng)無(wú)法重復(fù),在生命科學(xué)研究領(lǐng)域,在追求創(chuàng)新性,第一性的同時(shí),臨床前研究結(jié)果可重復(fù)性差,這個(gè)值得我們從業(yè)者去反思,也許基礎(chǔ)研究領(lǐng)域需要借鑒藥物研發(fā)企業(yè)的一些經(jīng)驗(yàn),做好生物功能學(xué)方法開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證的工作,在得到陽(yáng)性結(jié)果前,先問一句,用來(lái)得到此陽(yáng)性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)方法是否可靠?



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