檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被巴氏桿菌皮膚壞死毒素（PMT）微孔中，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），與CUT OFF值相比較，從而判定標(biāo)本中巴氏桿菌A型抗體（Pasteurella-AAb）的存在與否。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無(wú) |
陰性對(duì)照 | 0.5mL | 0.5mL | 無(wú) |
陽(yáng)性對(duì)照 | 0.5mL | 0.5mL | 無(wú) |
檢測(cè)抗原-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
說(shuō)明書 | 1份 | 1份 | 無(wú) |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50μL；
3. 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4. 隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
1. 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；
陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。
2. 臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性
4. 陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。
2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
4. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
5. 有效期：6個(gè)月
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